血清学诊断

来源:布病科   发布时间:2021年05月25日 10:16   作者:  打印本页  分享到:
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  血清学的检测方法因为其操作简单,检测时间短,生物风险小,国际国内均有统一的结  

  果判定标准等优点,目前仍是临床诊断及疾控机构进行大规模筛查和确证的常用检测方法。  

  现在较为常用的有虎红平板凝集试验(RBT)、胶体金免疫层析技术(GIGA)、酶联免疫吸附  

  试验(ELISA)、试管凝集试验(SAT)、抗人球蛋白试验(Coomb’s  

  test)、补体结合试验 (CFT)、等方法。 血清学检查仍然存在很多缺点。首先,由于抗原的共同性,血清学检测会对某些革兰阴 性菌种产生交叉反应。其次,在已接受过治疗的患者中,血清学检测结果可在患者恢复之后 持续很长时间仍为阳性,因此并不一定能根据血清学检查结果来区分活动性感染与既往感染。 第三,犬布鲁氏菌感染不会引起机体产生与标准布鲁氏菌抗原有交叉反应的抗体。如果怀疑 为犬布鲁氏菌感染,或是怀疑布鲁氏菌感染但 SAT 结果为阴性时,应专门要求实验室进行针对犬布鲁氏菌的血清学检查。因此,由于假阳性和假阴性的存在,建议同时采用两种以上血清学检测方法。  

  一、血清学检测样本的采集  

  1.  

  用无抗凝剂采血管收集 2 ml~3 ml 静脉血,在管壁上做好标记。  

  2.  

  血标本不能冷冻,待自然凝固后再 2000~3000rpm 离心 8 分钟,用于分离血清;如  

  果无离心机,血标本应于 4℃冷藏放置,直到血清完全析出。  

  3. 小心吸取血清,避免吸到红血球,在无菌条件下,移至带外螺旋盖的血清管中,在  

  管壁上做好标记。  

  4. 分离好的血清标本应当尽快进行检测,如不能及时检测的可冷冻保存,但应避免反  

  复冻融。 

  二、 虎红平板凝集试验(RBT)  

  (一)原理  

  虎红平板凝集试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。由于所用的抗原是酸性(pH 值  

  3.6-3.9)带色的抗原,该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的 IgM 类抗体的凝集活性,  

  因此提高了该项反应的特异性。  

  (二)器材及试剂  

  1. 器材:清洁玻片、0.1ml 吸管或微量加样器、混合棒。85  

  2. 试剂:虎红平板凝集抗原、阴性和阳性对照血清、待检血清。  

  (三)操作方法:  

  1. 在玻片上加 30μl 待检血清,然后加入虎红平板抗原 30μl,充分混匀,在 5 分钟  

  内观察结果。  

  2. 每批次实验同时用阴性、阳性血清作对照。  

  (四)结果判定  

  玻片上出现可见的凝集反应就判为阳性;液体均匀混浊判为阴性。  

  (五)意义  

  1.  

  简便、快速、容易操作,适用于基层大面积筛查。  

  2.  

  有一定敏感性,检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。  

  3.  

  因为在酸性环境下 IgM 活性受抑,此法主要是检查 IgG 类凝集抗体,所以特异性较  

  好,与补体结合试验、含巯基化合物凝集试验和抗球蛋白(Coomb’s)试验有较高的吻合率。  

  三、胶体金免疫层析试验(GIGA)  

  (一)原理  

  胶体金能通过物理作用稳定又迅速地吸附蛋白而不改变蛋白的生物活性,布氏菌胶体金  

  免疫层析检测板正是利用该技术用金标记 proteinA 以间接法来检测血清中的抗布氏菌抗  

  体,检测时,样本中含有的布鲁氏菌抗体与固定在特殊纤维膜上的金标 proteinA 反应形成  

  复合物,经毛细引力作用向前移动至检测板的检测区,被固定在膜上的布氏菌抗原捕获,形  

  成一条深红色反应线,包被膜上同时包被有一条质控线作为对照,如样本中无布鲁氏菌抗体,  

  未被结合的金标物移动到检测板的对照区仅与质控线形成一条红线。  

  (二)器材及试剂  

  1.  

  器材:0.1ml 吸管或微量加样器。  

  2.  

  试剂:测试卡(包被布鲁氏菌菌体抗原)、缓冲液、待检血清。  

  (三)操作方法  

  1.  

  在对照孔滴入待检血清、血浆或全血;  

  2.  

  将缓冲液加入缓冲液孔;  

  3.  

   3-20 分钟内判读结果。  

  注:根据试剂盒说明书来进行检测。  

  (四)结果判断  

  测试卡对照区域(C)内显示红色线条,为此试验结果可信;测试区域(T)显示红色线  

  条,试验为阳性,显示白色为阴性。如对照区域(C)内未出现红色线条,则为无效实验。  

  注:根据试剂盒说明书来进行判读结果。  

  (五)意义86  

  1.  

  此方法简便、快速、容易操作,适于基层大规模的筛查。  

  2.  

  此方法既可以检测 IgM 类抗体,又可以检测 IgG 类抗体。 

    

  酶联免疫吸附试验(ELISA)  

  (一)原理  

  ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗  

  原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。  

  在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗  

  涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗  

  原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一  

  定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质  

  的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地  

  放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。  

  酶联免疫吸附试验可以检测人体内的布鲁氏菌 IgM、IgG 等免疫球蛋白,实验原理、方  

  法可能有差别,具体实验参照试剂盒说明书检测和做出实验诊断。 

  (三)操作方法  

  1.  

  检测前准备:按照说明书配制洗涤液、稀释液,稀释待检血清。  

  2.  

  吸取 100μl 的各阴阳性对照液和稀释的样品,分别加入到相应酶标板孔中。  

  3.  

  用黏性覆膜盖住酶标板,在 18℃~25℃孵育 60 min。87  

  4. 移去覆膜,弃去酶标板液体。每孔加入稀释好的稀释液 300μl,洗板 3 次,将板倒  

  置在纸巾上除去剩余液体。  

  5. 使用移液器加入 100μl 酶交联物;取新的覆膜盖住酶标板,在 18 ℃~25 ℃孵育  

  30 min; 

  6.  

  重复步骤 4。  

  7.  

  使用移液器加底物液和终止液,加底物液和终止液的间隔时间应一样,加样时应避  

  免产生气泡。  

  8. 每孔加100μl的TMB底物液,取新的黏性覆膜盖住酶标板,在18℃~25℃孵育20 min  

  后,每孔加入 100μl 的 TMB 终止液终止酶促反应,轻荡酶标板使其混匀,颜色由蓝变黄为  

  止。 

  9. 在加入终止液的 60 min 内,在 450 nm 处检测吸光度。 

  (四)质量控制  

  1.  

  阴性、阳性标准品的 OD 值在质控要求的范围内。  

  2.  

  试验用仪器、加样器必需经过严格的校验或标定。  

  3.  

  试剂应在规定的储存条件下存储,在有效期内使用。  

  (五)结果判定  

  参照说明书使用酶标仪读取样品的 OD 值。以标准的 OD 值为 y 轴,标准品的浓度为 x  

  轴,在对数坐标纸上做一条标准曲线。然后在曲线上读取相应样品的浓度值。结果判定情况  

  如下: 

  1.  

  OD 值>12  

  U/mL 为实验阳性;  

  2.  

  OD 值在 8  

  U/ml~12 U/ml 为实验可疑;  

  3.  

  OD 值<8 U/ml 为实验阴性。  

  (六)意义  

  1. 酶联免疫吸附试验具有敏感、特异、快速等优点,现已广为采用。其敏感性高于 SAT,  

  在鉴别菌苗接种和自然感染上有一定意义。  

  2. 该试验步骤较多,需酶标仪等设备,因此在一定程度上影响其在基层的广泛应用。 

    

  五、试管凝集试验(SAT)  

  (一)原理  

  布病的病人血清可以与布鲁氏菌培养物产生凝集现象,是最常用的血清学诊断方法之一。  

  关于凝集反应的原理,还没有完善的解释,目前有两种学说。  

  万字格学说:这个学说假定抗原与抗体之间具有特异性化学亲和力,当它们比例合适时,  

  则构成一个万字格状的大复合物,肉眼可以看到凝集现象。抗原过多或抗体过多,则复合物  

  不够大,肉眼看不到极性基吸附学说:抗原与抗体都是蛋白质,具有胶体性质。二者都含有特异性的极性基,  

  与水有很强的亲和力,属于亲水胶体,而且当所有的胶体粒子都带有同样的电荷时,因互相  

  排斥,胶体稳定不易发生凝集。属于抗原与抗体反应时,它们相对应的极性基能互相吸附,  

  这些极性基互相吸附后,则不能再和水分子结合,因而失去亲的性质,变为憎水胶体。此时  

  在电解质(一般用生理盐水)的作用下,失去电荷互相粘附,呈现肉眼可见的凝集反应。  

  (二)器材及试剂  

  1. 器材:1ml、10ml 吸管或加样器、玻璃试管、试管架、稀释抗原用的洁净容器、37℃  

  培养箱。 

  2. 试剂:试管凝集抗原、被检血清、生理盐水或 0.5%的石碳酸生理盐水。  

  (三)操作方法  

  1.  

  每份血清取 9 支小试管,放于试管架上。  

  2.  

  血清稀释:第一只管加盐水 2.3ml,第二只不加,第三只到第九只管各加 0.5ml 盐  

  水。然后用 1ml 吸管取被检血清 0.2ml 加入第一管中,混匀后吸 1ml 加入第二、三管各 0.5ml,  

  第三管混匀后再吸 0.5ml 加入第四管,以此类推到第八管吸 0.5ml 弃掉。此时血清的稀释倍  

  数从第二管开始到第八管分别为 1:12.5、1:25、1:50、1:100、1:200……1:800。  

  3. 加入抗原:将试管凝集抗原充分混匀后,稀释成使用液(具体稀释倍数参看试剂说  

  明),然后从第二管开始每管加入 0.5ml,加入抗原之后,血清的最终稀释倍数为从第二管  

  开始 1:25、1:50、1:100、1:200……1:1600,第一管为血清对照,最后一管为抗原对  

  照,充分混匀。  

  4. 将试管全部放于 37℃温箱中孵育,20-22 小时后取出,在室温下放置 1-2 个小时后  

  观察结果 

  结果判读  

  “++++”液体完全透明,管底有伞状凝集,有时会有卷边,为 100%凝集;  

  “+++” 液体近于完全透明,管底有伞状凝集,为 75%凝集;  

  “++” 液体略微透明,菌体呈较薄伞状凝集,为 50%凝集;  

  “+” 液体不透明,管底有不很明显的凝集,为 25%凝集;  

  “—” 液体不透明,无凝集现象。  

  4.  

  效价:以产生 50%凝集的(++凝集程度)血清最终稀释倍数为受检血清的效价。  

  5.  

  诊断标准  

  1)人、大型畜血清试验的标准是凝集效价为 1:100++及以上为阳性;小型畜(多指  

  犬)凝集效价为 1:50++及以上为阳性;或者慢性布鲁氏菌病病人滴度为 1:50++及以上为阳  

  性。 

  2)对于出现可疑反应的情况应在 10-25 天内重复检查,以便进一步确定诊断。  

  3)进行试管凝集实验时,有个别血清会出现前滞现象,即稀释度低的血清管内不发  

  生凝集,而稀释度高的管内出现凝集。如果出现此现象,应当多做几管,采用更多的稀释度  

  来判断。 

  (五)意义  

  1.  

  该方法特异性较好,敏感性也高,因此适用于临床诊断。  

  2.  

  由于该试验有时出现前带现象和封闭现象,所以有时也出现假阴性结果,必要时和  

  其它方法联合应用。  

  六、抗球蛋白试验(Coomb’s)  

  (一)原理 

    

  机体受布氏菌抗原刺激后可产生“完全抗体”和“不完全抗体”。不完全抗体虽可与相  

  应抗原结合,但不出现可见反应。若将预测不完全抗体的人或动物血清球蛋白作为抗原,注  

  射于另一种动物(常用家兔)制成抗此球蛋白(抗 IgG、IgA、IgM)的抗体,再将此抗球蛋  

  白抗体加入抗原与不完全抗体复合物中,即可出现可见反应。因此,抗球蛋白试验分为两个  

  阶段:一为不完全抗体与相应抗原结合——不可见阶段;二为抗原-抗体复合物由抗球蛋白  

  抗体凝结起来形成可见反应。  

  (二)器材及试剂  

  1.  

  器材:普通离心机、37℃培养箱、1ml 及 10ml 吸管或加样器、玻璃试管。  

  2.  

  试剂:试管凝集抗原、被检血清、抗被检对象的血清球蛋白抗体、生理盐水。  

  (三)操作方法  

  1. 试管凝集反应阶段:按常规进行试管凝集试验,在 37℃温箱中放 20-22 小时,取出  

  放室温 2 小时后判定结果。  

  2. 抗球蛋白反应阶段:选取上项试验的可疑管和全部阴性管,4000-5000 转/分离心 20  

  分钟,弃上清,如此反复洗涤 3 次。向各管中加入生理盐水 0.5ml,混匀,然后再向各管中  

   0.5ml 一定稀释度的(一般是 1:20~1:50 稀释)抗球蛋白血清(参看试剂说明)。将反应  

  管置 37℃温箱中 20-22 小时,取出放室温 2 小时后判定结果。判定标准同试管凝集反应。  

  此反应包括以下对照。  

  1)被检血清对照 (被检血清+盐水)  

  2)试管凝集抗原对照 (试管抗原+盐水)  

  3)抗球蛋白血清加生理盐水对照 (抗球蛋白血清+盐水)  

  4)抗球蛋白血清加试管凝集抗原对照 (抗球蛋白血清+试管抗原)  

  5)抗球蛋白血清加被检血清对照  

  (抗球蛋白血清+被检血清)  

  (四)结果判定  

  当上述对照全部为阴性时,试验才有意义。尚无统一公认的诊断标准。我国试行的用于  

  诊断人布病标准为 1:400(++)及以上滴度 

  (五)意义  

  1. 布氏菌感染后,约在 15 天出现不完全抗体,3 个月左右达高峰,可持续 1 年左右。  

  故该试验可作为早期和追溯诊断。  

  2. 该试验的敏感性高于试管凝集反应,但亦应看到此反应是在凝集反应阴性管中进行  

  的,只要一出现阳性就高于凝集反应。因此不能从滴度上判定敏感性,而应从群体阳性率上  

  判定。 

  3.  

  该试验所查抗体主要是 IgG、IgA 类,特异性较强,尤其适用诊断亚急性和慢性病人。  

  4.  

  鉴于该试验操作复杂,耗时较长,故影响其实用价值。所以此试验一般不作为常规91  

  检查项目,在试管凝集试验结果为可疑,患者又处于慢性期时,可考虑作抗球蛋白试验予以  

  诊断。 

  七、半胱氨酸凝集试验  

  (一)原理  

  本实验原理除同一般的试管凝集反应外,因巯基化合物的分子中含有巯氢基(HS),该  

  化学基团可以使大分子免疫球蛋白分解成无凝集活性的 6.5S~7S 球蛋白。但这种能使大分子  

  免疫球蛋白(IgM) 双硫键破坏的化合物浓度不能使具有凝集活性的 7S 小分子免疫球蛋白  

  IgG)抗体分解。  

  基于这种原理建立起来了二巯基乙醇凝集试验和半胱氨酸凝集试验,现国内普遍应用半 

  胱氨酸凝集试验。  

  (二)器材及试剂  

  1. 器材:1ml、10ml 吸管(或加样器)、玻璃试管、试管架、稀释抗原用的洁净容器、  

  37℃培养箱。  

  2. 试剂:用 0.4N  

  NaOH 配制的 0.2M 半胱氨酸盐酸盐溶液、试管凝集抗原、被检血清、  

  阳性血清、阴性血清、生理盐水或 0.5%的石碳酸生理盐水。  

  (三)操作方法  

   1:5 生理盐水稀释的血清与等量的 0.2M 半胱氨酸盐酸盐溶液混匀,置 37℃培养箱 30  

  分钟,取出后用生理盐水做倍比稀释,然后加入 0.5ml 试管凝集抗原(方法参照试管凝集  

  试验),混匀,同时做抗原和 0.2M 半胱氨酸盐酸盐处理后的被检血清、阳性、阴性对照,置  

  37℃培养箱 18~20 小时,取出后在室温置 2 小时判定结果。  

  (四)结果判定  

  判定方法同于试管凝集反应。尚无统一的诊断标准,一般以 1:40(++)以上为人及大  

  型牲畜阳性标准。  

  (五)意义  

  1.此试验主要反映的是 IgG 抗体的凝集活性,故对感染和免疫有一定的鉴别诊断意义。  

  2.因为与布氏菌出现的血清交叉反应或其他菌属与布氏菌的血清出现的低滴度反应大  

  多都是由于 IgM 类抗体所致,故用此反应可以在一定程度上排除非特异的反应。  

  3.该试验与补体结合试验、抗球蛋白试验有较好的吻合性。  

  4.该试验对判定群体感染和免疫状态较好。  

    

  布鲁氏菌病的诊断与鉴别诊断  

    

  第一节  

  布鲁氏菌病的诊断原则  

  布鲁氏菌病的发生、发展和转归比较复杂,其临床表现多种多样,很难以某一种症状来  

  确定诊断。对布鲁氏菌病的诊断,应结合病人流行病学接触史、临床表现、实验室检查和影  

  像学表现等情况的综合判断。 

  第二节  

  布鲁氏菌病的诊断依据  

  一、流行病学史  

  发病前病人与疑似布鲁氏菌感染的家畜、畜产品有密切接触史,生食过牛、羊、骆驼等  

  肉制品(未加工熟的肉制品)、乳制品,或生活在布鲁氏菌病疫区;或从事布鲁氏菌培养、  

  检测或布鲁氏菌疫苗生产、使用等工作。  

  二、临床表现  

  1.  

  患者出现持续数日乃至数周发热(包括低热),多汗,乏力,肌肉和关节疼痛等。  

  2.  

  部分患者淋巴结、肝、脾和睾丸肿大,少数患者可出现各种各样的充血性皮疹和黄  

  疸;急慢性期患者可以表现为骨关节系统损害。具体临床表现见。  

  三、实验室检查  

  3.1 实验室初筛  

  3.1.1  

  虎红平板凝集试验(RBT)结果为阳性。  

  3.1.2  

  胶体金免疫层析试验(GICA)结果为阳性。  

  3.1.3  

  酶联免疫吸附试验(ELISA)结果为阳性。  

  3.1.4  

  布鲁氏菌培养物涂片革兰染色检出疑似布鲁氏菌。  

  3.2  

  实验室确诊(参照中华人民共和国卫生行业标准 WS269-2019 布鲁氏菌病诊断)  

  3.2.1  

  从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物等任一种病理材料培养物中分离到布鲁  

  氏菌 

  3.2.2  

  试管凝集试验(SAT)滴度为 1:100++及以上,或者一年以上慢性布鲁氏菌病病  

  人滴度为 1:50++及以上。  

  3.2.3  

  补体结合试验(CFT)滴度为 1:10++及以上。  

  3.2.4  

  抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)滴度为 1:400++及以上。 

    

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